PATOGENICIDAD BACTERIANA EN MAÍZ (Zea mays)

Bacterial Pathogenicity IN CORN

Rocío Pérez-y-Terrón
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
rocperez33@hotmail.com

Julio César Carmona Díaz
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
julio.cesarcd@hotmail.com

Jorge Alejandro Cebada Ruíz
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
 jcebadac@yahoo.com.mx

José Antonio Munive Hernández
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
munive68@yahoo.com.mx

Resumen
El maíz es un grano de consumo mundial para alimento tanto humano como animal. México se encuentra en el séptimo lugar de la producción, China y Estados Unidos son los principales consumidores. Zea mays pertenece a la familia de las gramíneas y tiene producción anual. La planta se puede ver afectada por plagas principalmente de diferentes especies de insectos. Puede también desarrollar enfermedad debida a hongos y virus, así como a bacterias patogénicas. Dentro de estas la causada por organismos del género Pantoea.  P. stewartii  se sabe que tiene genes como cps que codifican para la producción de exopolisacarido sterwatan controlada por un mecanismo de quórum sensing, y hrp para el sistema de secreción tipo III involucrados en la patogenicidad de la bacteria.  En la descripción del genoma de P. ananatis se identifica posibles determinantes de patogenicidad como para el EPS ananatan; no contiene sistemas de secreción II y III pero si el IV, los cuales pueden estar relacionados con su patogenicidad. Hemos aislado P. ananatis de cultivos de maíz y amplificado secuencias para cps y  hrp. Se ha probado la patogenicidad en plántulas de maíz y frijol observándose las lesiones de mancha blanca, clorosis y zonas necróticas de las hojas.

Palabras clave: Zea mays, patogenicidad, Pantoea.

ABSTRACT
Corn is a grain world for both human consumption and animal feed. Mexico is in the seventh place of production, China and the U.S. are the main consumers. Zea mays belongs to the grass family and has annual production. The plant can be affected by pests mainly of different species of insects. It can also develop due to disease fungi and viruses, as well as pathogenic bacteria. Within these caused by organisms of the genus Pantoea. P. stewartii is known to have such cps genes encoding exopolysaccharide production sterwatan controlled by quorum sensing mechanism, and hrp for type III secretion system involved in pathogenicity of the bacteria. In the description of the genome of P. ananatis possible pathogenicity determinants to identify the EPS ananatan; contains no secretion systems II and III but the IV, which may be linked to pathogenicity. We have isolated P. ananatis of corn and amplified sequences and hrp cps. Have been tested for pathogenicity in maize and bean seedlings observed white spot lesions, chlorosis and necrotic areas of leaves.
Key words: Zea mays, pathogenicity, Pantoea.
Fecha recepción:   Julio 2011           Fecha aceptación: Noviembre 2011

Introducción

La semilla de maíz está contenida dentro de un fruto denominado cariópside; la capa externa que rodea este fruto corresponde al pericarpio, estructura que se sitúa por sobre la testa de la semilla. Esta última está conformada internamente por el endosperma y el embrión, el cual a su vez está constituido por la coleorriza, la radícula, la plúmula u hojas embrionarias, el coleoptilo y el escutelo o cotiledón (OIEDRUS, 2007).
La composición promedio de un cariópside de maíz perteneciente a la especie Zea mays L. var. indentata (Sturtev.) L. H. Bailey, es de un 65 a 70% de almidón, 1 a 2% de azúcares, 10 a 11% de proteína; un 4 a 5% ce fibra con la mitad (2 a 2.5%) de fibra y 1 a 2% de ceniza. El porcentaje de humedad relativa es entre 12 y 13% (OIEDRUS, 2007; FAO, 2007).

El mercado de nacional de maíz está compuesto por diversas variedades entre las que destacan el maíz blanco y el amarillo, pero también existen otras variedades como el maíz de color y el pozolero, siendo las dos primeras variedades son las que ocupan una importante participación en la producción y comercialización. (SE, 2012).
La producción en México para el periodo 2012/2013 es principalmente de maíz en grano con 17,635,417.30 Tons, con un rendimiento de 7.28 Ton/Ha; seguida de maíz forrajero con 9,605,147.84 Tons y un rendimiento de 30.86 Ton/Ha; seguida de maíz grano para semilla y maíz palomero con una producción de   24,721.94 y  472.60  Tons respectivamente (SIAP, 2013).
México es un país históricamente deficitario en la producción-consumo de maíz, debido a que la producción interna no es suficiente para abastecer la demanda requerida. El mercado de importación, acopio y comercialización está concentrado en pocas empresas, quienes lo almacenan y distribuyen, no permitiendo la entrada de nuevos competidores (SE, 2012).
Patologías causadas en el maíz
El maíz, como muchos otros cultivos es susceptible a diversas enfermedades que afectan el desarrollo de la planta y su fruto. Las enfermedades se ven favorecidas por las condiciones ambientales, el tipo de suelo, la susceptibilidad de los materiales, y cuando son enfermedades causadas por agentes virales, se afecta por condiciones que favorezcan la migración, supervivencia y establecimiento de vectores (Varón y Sarria, 2007).
Las principales enfermedades del maíz suelen ser causadas por hongos y virus, ocasionando grandes pérdidas económicas, en menor grado se presentan las enfermedades causadas por bacterias que ocasionan relativamente menores daños y costos económicos. La mayoría de las plantas, silvestres y cultivadas tienen inmunidad innata o resistencia a muchos patógenos. Sin embargo, muchas plantas pueden hospedar fitopatógenos sin desarrollar síntomas (asintomáticas) (Vidaver et al, 2004; Infoagro, 2013).
Existen diferentes patologías en el maíz, algunas son debidas a la presencia y establecimiento de plagas como los insectos, en  ellos el  gusano de alambre que se presenta en suelos arenosos y ricos en materia orgánica. Estos gusanos son coleópteros del género Conoderus y Melanotus, ocasionan grave deterioro en la planta e incluso la muerte. Los gusanos grises, son larvas de clase lepidópteros pertenecientes al género Agrotis. La especie Agrotis ípsilon provoca daño a nivel del cuello de la planta produciéndoles graves heridas (Infoagro, 2013).  

Los pulgones como Rhopalosiphum padi, se alimentan de la savia provocando una disminución del rendimiento final del cultivo. Mientras que el pulgón verde del maíz Rhopalosiphum maidis es transmisor de virus al extraer la savia de las plantas atacando principalmente al maíz dulce, esta última especie tampoco ocasiona graves daños debido al rápido crecimiento del maíz. La piral del maíz Ostrinia nubilalis, que es un gusano barrenador del tallo y desarrolla de 2 a 3 generaciones larvarias llegando a su total desarrollo alcanzando los 2 cm de longitud. Las larvas comienzan alimentándose de las hojas del maíz y acaban introduciéndose en el interior del tallo. Los tallos acaban rompiéndose y las mazorcas que han sido dañadas también (Infoagro, 2013).

Los taladros del maíz son dos plagas ocasionadas por Sesamia nonagrioide, un lepidóptero cuya oruga taladra los tallos del maíz produciendo numerosos daños. La oruga mide alrededor de 4 cm, pasa el invierno en el interior de las cañas de maíz donde forman las crisálidas. Las mariposas aparecen en primavera depositando los huevos sobre las vainas de las hojas; Pyrausta nubilalis, la  oruga de este lepidóptero mide alrededor de 2 cm de longitud, cuyos daños se producen al consumir las hojas y excavar las cañas de maíz. La puesta de huevos se realiza en distintas zonas de la planta (Infoagro, 2013).
Entre algunos ejemplos de las principales enfermedades bacterianas tenemos la provocada por Pseudomonas alboprecipitans, se manifiesta como manchas en las hojas de color blanco con tonos rojizos originando la podredumbre del tallo.  H. turcicum afecta a las hojas inferiores del maíz. Las manchas son grandes de 3 a 15 cm y la hoja va tornándose de verde a parda. Sus ataques son más intensos en temperaturas de 18 a 25ºC. Las hojas caen si el ataque es muy marcado. La Antranocsis se debe a la presencia de Colletotrichum graminocolum. Las lesiones que provoca son manchas color marrón-rojizo y se localizan en las hojas, producen arrugamiento del limbo y destrucción de la hoja (Infoagro, 2013; Varón y Sarria, 2007).
La plaga bacteriana por Acidovorax avenae subsp. avenae, causa rayas o manchas largas y estrechas de la hoja, con bordes marrón, las hojas son fácilmente cortadas y esto puede estar asociado a la pudrición del tallo alto. Burkholderia  andropogonis produce rayas largas, paralelas, de color verde olivo a amarillo y lesiones de humedad (empapado), las hojas superiores pueden estar casi blancas. La marchitez de la hoja del maíz del Norte producida por Setosphaeria turcica da lugar a largas manchas similares a formas de ejes de color gris verdoso; pero la marchitez de la hoja producida por Cochiobolus heterostrophus, y la mancha de la hoja de maíz producida por C. carbonum causan manchas bien definidas color naranja a café. (Stack et al, 2002).
Clavibacter michiganensis sbsp. nebrakensis provoca síntomas parecidos a la enfermedad de Stewart, con lesiones de aspecto húmedo paralelas a las nervaduras de las hojas de color verde intenso a negro. En la infección por  Pseudomonas syringae pv. syringae, se observan manchas pequeñas en las puntas de las hojas inferiores de color verde que posteriormente se torna a café rojizo. En lesiones avanzadas se observa un halo amarillento que las rodea. Xhantomonas translucens se transmite en las semillas probando la raya bacteriana y Rathayibacter tritici ataca con la pudrición de la espiga (CIMMYT, 2013). 
Pantoea stewartii provoca la enfermedad de Stewart reportada en 1897 en New York sobre maíz dulce.  Actualmente no se presenta de manera importante en América del Centro y del Sur donde se originó el maíz. Pantoea stewartii subsp. stewartii  puede también transmitirse a partir de suelo, abono o tallos de maíz durante el frío invierno. El agente principal responsable de la dispersión en USA es el escarabajo Chaentocnema pulicaria, pero además se puede presentar en otros vectores como Diabrotica undecempunctata howardii (tanto el adulto como la larva), Chaentocnema denticulata, la larva de Delia platura, Agriotes mancus, Phyllophaga sp. y la larva de Diabrotica longicornis.  Cuando el escarabajo migra, puede ser acarreado desde distancias considerables a través de corrientes de aire y transmitir a la bacteria (OEPP/EPPO, 2006).
El principal hospedero es el maíz dulce (Zea mays var. saccharata) el más susceptible, pero también el dentado (Z. mays var. indentata) que usualmente es más resistente, el maíz para harina y cultivares de maíz palomero (Z. mays var. everta), sorgo y mijo (Margaret et al, 2004). P. stewartii ha sido inoculada artificialmente en Coix lachrymajobi, Setariapumila y Zea perennis causando daños a la planta (OEPP/EPPO, 2006, Stack et al., 2002, Merighi M., 2003).
La bacteria también ataca otras poáceas cultivadas para forraje en Norteamérica como Tripsicum dactiloydes y teocinte (Zea mexicana). Se han reportado notables excepciones de brotes esporádicos en máiz dulce reportados en Italia, Austria y México (Valle de Toluca, Oaxaca, Tabasco, Tlaxcala y Veracruz). En estos países  se desconoce cómo se dispersa la enfermedad a través de un foco inicial y el subsecuente establecimiento, pero en los países donde si se presenta, muestran quizá la potencial capacidad de P. stewartii para adaptarse a  combinaciones del vector  o a la presencia de hospedero secundarios (Stack et al, 2002).
Los síntomas de la hoja rayada pueden ser confundidos con deficiencias nutricionales o sequía. Se reportó también la presencia de Pantoea ananatis como causante de la mancha blanca, clorosis y necrosis con pérdidas en los cultivos (Pérez-y-Terrón et al, 2009).
Patogenicidad
Existen dos grupos de genes que juegan un papel importante en la patogenicidad y virulencia de las bacterias que infectan al maíz. En el presente capítulo se hace referencia al género Pantoea. Uno es el de cps, que comprende 12 genes y que es requerido para la producción del exopolisacárido (EPS) “sterwatan”,  el otro es el grupo de hrp, que codifica para un sistema de secreción tipo III, necesario para la patogenicidad general y la producción de las lesiones de las hojas (Cha et al, 1998).
El cluster cps, específicamente los de la región de cpsD y cpsE codifica para la síntesis de proteínas responsables del ensamblaje y secreción de unidades repetidas, así como su polimerización dentro de una macromolécula de exopolisacárido (EPS) conocido como sterwatan. Este  EPS bloquea el flujo libre del agua, conduciendo a la condición de marchitez. Se ha propuesto que el EPS puede funcionar para prolongar los síntomas de Wts (síntoma de empapamiento por agua) y potenciar el desarrollo bacteriano para contener el agua y los nutrientes en los espacios intercelulares (Coplin et al, 1992). 
El sterwatan consiste de una unidad de aproximadamente 45MDa, con siete monosacáridos repetidos que contienen  glucosa, galactosa y ácido glucurónico en una proporción 4:2:1, proporciona una barrera de protección contra los factores de defensa de la planta hospedera y contribuye parcialmente, a la inducción de los síntomas tempranos de la enfermedad (Coplin et al, 1992; Labate et al, 2007; Merigui et al, 2006).

La producción de EPS está controlada por un mecanismo de quorum sensing y es regulado por la proteína EsaI producida por esaI, que es la señal sintasa de la homoserina lactona (HSL) y EsaR producida por esaR, que es el regulador transcripcional que gobierna al locus cps (Coplin et al, 1992; Wang and Leadbetter, 2005; González and Keshavan, 2006; Minogue et al, 2005).

Si se muta la secuencia de esaI, se bloquea la producción de 3-oxohexanoil-HSL y algunas otras acil-HSL detectables; esta deficiencia suprime la producción de EPS y elimina la capacidad de P. stewartii de producir la enfermedad de Stewart en la planta hospedera.  En tanto, cuando se da una mutación en esaR produce altos niveles de EPS, independientemente de la densidad celular y aún en ausencia de la señal HSL. EsaR reprime la síntesis de EPS a baja densidad celular (Von Bodman and Farrand, 1995; Von Bodman et al, 1998).
Para que el gen deje de reprimirse requiere cantidades micromolares de HSL produciendo constitutivamente el EPS, pero las cepas son menos virulentas que las de tipo silvestre. Se sugiere que el mecanismo de quorum sensing puede demorar la expresión de EPS durante los estados tempranos de la infección, haciendo que esta no interfiera con otros mecanismos de patogénesis (Von Bodman et al, 1998, Minogue et al, 2005).
El EPS es requerido para la formación de la biocapa y el rápido movimiento sistémico en la planta, las cepas deficientes en EPS crecen y se dispersan más lentamente en los tejidos vasculares del hospedero, son menos parecidas a las cepas tipo para colonizar las plantas sistémicamente y son incapaces de causar marchitez en plantas infectadas (Merighi M., 2003).
La síntesis de la cápsula es constitutiva pero la producción de limo adicional está inducida por la disponibilidad de azúcares libres en el medio de desarrollo. En suma todo esto está involucrado en la virulencia, el EPS posiblemente realiza un mecanismo para la protección de fitoaglutininas en los conductos y  la colonización del insecto vector. La mayoría de estos genes  que la producen están conservados en E. amylovora y E. coli basados sobre la secuencia de homología  y pruebas de complementación interespecíficas, excepto para algunos genes glucosiltransferasa que pueden considerarse diferentes en la estructura de los dos polisacáridos (Merighi M, 2003).
Los genes ams clonados de E. amylovora complementaron la mayoría de las mutantes cps de P. stewartii para la producción de limo y la virulencia en semilleros  de maíz, pero el arreglo de los genes en los dos clusters se mostró ligeramente diferente (Merighi M., 2003, Sharples et al, 1990).
Los genes hrp son prescindibles para el desarrollo en medio mínimo, pero esenciales para la patogenicidad en hospederos susceptibles y para provocar respuesta hipersensible (HR) en hospederos incompatibles y no hospederos. La HR es una defensa rápida y localizada de la planta que involucra muerte celular programada, producción de oxígeno activo y síntesis de compuestos fenólicos y antimicrobianos alrededor del sitio de infección. Durante infecciones naturales, la reacción usualmente no es visible debido a que están involucradas pocas células hospederas y bacterianas, pero bajo condiciones experimentales con inóculos altos (>107/ml), se causará un colapso celular masivo y una necrosis confluente que se verá a simple vista. Esta reacción tiene el efecto neto de restringir la multiplicación del patógeno y el posterior progreso de la enfermedad (Merighi M, 2003; Merighi et al, 2001).
Las proteínas hrp/hrc  secretadas por los sistemas TTS (Sistema de Secreción Tipo III),  han sido nombradas Hops (por proteínas externas Hrp), en paralelo a la designación de las proteínas externas Yops de Yersinia. Al menos cuatro clases de Hops recorren el aparato de secreción: Harpins, pilinas Hrp, proteínas translocadoras y proteínas efectoras. Las tres primeras están definidas colectivamente como proteínas ayudadoras por su presunto o demostrado papel en auxiliar la translocación/secreción de otros sustratos de los sistemas TTS (Frederick et al, 2001).
Las harpins son proteínas hidrofílicas, ricas en glicina, libres de cisteína y estables al calor, que son capaces de provocar una HR cuando son infiltradas a alta concentración dentro del apoplasto. Ellas viajan a través del aparato TTS pero son liberadas dentro de los espacios apoplásticos, más que ser inyectadas dentro de las células hospederas. Las harpins han sido descritas en E. amylovora (harpin Ea o HrpN y HrpW), en otras erwinias, en todos los patovares de P. syringae estudiados y en R. solanacearum, pero no existe similitud en la secuencia entre las proteínas HrpN, HrpW, HrpZ y PopA1 (Frederick et al, 2001;  Merighi et al, 2006).
Cada bacteria fitopatógena responde de manera un tanto diferente a las señales externas y condiciones de desarrollo, como en las señales necesarias para inducir la expresión de los genes hrp en P. stewartii, Pseudomonas syringae o Erwinia amylovora (Merighi et al, 2001). La regulación de hrpS es llevada a cabo por reguladores tanto específicos como globales, por lo que puede ser “afinada” según las condiciones de cada nicho en el que se encuentre el patógeno (Merighi et al, 2001).
En la especie Pantoea ananatis se ha reporteado la secuencia del genoma en de la cepa LMG20103 patógena de Eucalyptus.  El genoma consiste de un cromosoma único con un tamaño de 4.69 millones de nucleótidos y un contenido de G+C de 53.69% y un total de 4,27 genes que codifican para proteínas. Se ha revelado la presencia de 433 genes que codifican para proteínas los cuales demostraron experimentalmente jugar un papel en la enfermedad (Maayer et al, 2010).
Se reportó también la ausencia de los sistemas de secreción tipos II y III, los cuales juegan un papel importante en la enfermedad  tanto en bacterias patógenas de animales como de plantas; pero tres copias del sistema de secreción tipo IV, descrito recientemente como factor de patogenicidad y donde la putativa proteína efectora  secretada vía estos sistemas de secreción, se adquiere a través de transferencia horizontal. Se identificaron algunos posibles determinantes de patogenicidad como el exopolisacárido ananatan demostrándose que juega un papel en la enfermedad de cebolla y piña (Maayer et al, 2010). La secuencia de la cepa de P. ananatis  PA13 consta de 4.87 Mb tiene 55 pseudogenes, 7 operones rRNA y 83 tRNAs, así como un plásmido de 281,754 bp (Choi et al, 2012).

Reportamos con anterioridad la identificación mediante 16S rDNA de P. ananatis aislada de plantas de maíz con daño severo (Pérez-y-Terrón et al, 2009). Las muestras fueron obtenidas de hojas, tallo y suelo adherido a la raíz, de plantas de maíz de los Estados de Puebla, Tlaxcala y Veracruz en México, identificándose 32 cepas.

Por otro lado, hemos utilizado oligonucleótidos iniciadores CPSL1 / CPSR2c descritos por Coplin et al en 2002 amplificando al 50% de las cepas identificadas, mediante PCR al fragmento de 1100 bp descrito. Estos oligonucleótidos están dirigidos hacia los genes del cluster cps, específicamente los de la región de cpsD y cpsE que codifica para la síntesis de proteínas responsables del ensamblaje y secreción de unidades repetidas, así como su polimerización dentro de una macromolécula de exopolisacárido (EPS) conocido como sterwatan.

Identificación y pruebas de patogenicidad
La utilización de los oligonucleótidos HRP1d/ HRP3c designados para amplificar un fragmento de 900 bp del marco de lectura abierto del gen hrpS, nos reportó 37.5 % de las cepas con dicho fragmento, y algunas de las cuales  también habían amplificado con los oligonucleótidos para cps. El gen hrpS, utilizando los primer hrp1d y hrp2c, son internos al marco de lectura abierto para hrpS. El producto obtenido de esta amplificación fue de 900 bp, codifica para un potenciador transcripcional similar a NtrC que es requerido para la expresión de genes de secreción hrp (respuesta de hipersensibilidad y patogenicidad) y el efector wts   (Coplin et al,  2002). Las cepas que presentaron el fragmento amplificado (55.5 %) dieron positiva la respuesta de hipersensibilidad en tabaco.
La utilización de los oligonucleótidos ES1G1/ ES1G2c  y ES1G2c/ES16 amplifican mediante la PCR, fragmentos de 920 y 290 bp respectivamente en todas las cepas de P. stewartii (Coplin et al, 2002). En  nuestros ensayos,  (16.6 %), también nos muestran ambas amplificaciones, pero (62.5%), sólo muestran la amplificación para el fragmento de 920 bp, esto resultaría inconsistente con el reporte de que las regiones cromosomales ITS que codifican para el rRNA varían considerablemente en especies relacionadas (Coplin et al, 2002).  Sin embargo, también reportan que P. ananatis amplifica también el fragmento de 290 bp y otras bandas inespecíficas para ambos juegos de oligonucleótidos.
Al realizar la inoculación en plántulas de maíz de 17 días de crecimiento, para la determinación de patogenicidad se utilizaron  cepas identificadas como Pantoea. Todas estas cepas fueron capaces de provocar un daño visible al ser inoculadas en plántulas a una dosis de 1X106 UFC en el desarrollo de las plantas de maíz. Se vió drásticamente reducido el tamaño de la raíz principal y el tamaño y cantidad de raíces secundarias, mostrando ausencia de éstas en algunas plantas. Los tallos fueron también reducidos en su tamaño así como las hojas, además de que algunas plantas carecían de ambos. Se pudo observar que las plantas con mayor deterioro, también presentaban mayor turbidez en el medio de cultivo, sugiriendo un aumento en la población bacteriana.
Al realizar estas pruebas con 5 de nuestras cepas identificadas como P. ananatis en plántulas de frijol Phaseolus vulgaris (réplicas de 5) obtuvimos resultados semejantes a los presentados en maíz, donde el total de las cepas provocó daño a las plántulas.
Conclusiones
La búsqueda de especies de Pantoea de suelo, tallos y hojas de plantas de maíz visualmente dañadas en cultivos de los Estados de Puebla, Tlaxcala y Veracruz de en México nos permitió detectar la presencia de Pantoea ananatis.
El ensayo de patogenicidad con plántulas de maíz, mostró un daño severo con las cepas, aisladas de tres diferentes parcelas.
Se determinó e identificó una secuencia parcial putativa para el locus cpsD de P. ananatis.
Se amplificaron los genes para hrpS.
Este trabajo fue realizado en parte con recursos otorgados por Promep.

Bibliografía
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